Diagnóstico de la anemia infecciosa equina

El artículo presenta una estrategia moderna para el diagnóstico serológico del INAN, así como la aplicación práctica de métodos alternativos para el diagnóstico del INAN en el laboratorio de virología VIEV.

Temas relacionados de artículos científicos en ciencias veterinarias, autor del artículo científico: Yurov Gleb Konstantinovich, Alekseenkova Svetlana Valerievna, Dias Jimenez Kristina Arturovna, Yurov Konstantin Pavlovich

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Métodos inmunológicos para el diagnóstico de la anemia infecciosa equina

La anemia infecciosa equina (AIE) se caracteriza por la persistencia del patógeno a largo plazo independientemente del curso clínico: agudo, subagudo y crónico. Los anticuerpos y el virus se presentan en la sangre de los caballos simultáneamente. La causa de los principales cambios patológicos en los caballos es un efecto inmunitario anormal de los complejos antígeno-anticuerpo. La respuesta inmune ocurre en las proteínas virales inmunodominantes responsables de la producción de anticuerpos. El método de diagnóstico estándar de EIA que permite identificar caballos infectados independientemente del curso clínico de la infección es la inmunodifusión en gel de agar (AGID — prueba de Coggins). Los métodos alternativos son ELISA e inmunoblot3ing. Para la detección directa del virus en algunos casos se utiliza el método de RT3PCR anidado

Métodos inmunológicos para el diagnóstico de anemia infecciosa en caballos

Métodos inmunológicos para el diagnóstico de la anemia infecciosa equina

G K. Yurov, Candidato de Ciencias Biológicas, S.V. Alekseenkova, Candidata a Ciencias Biológicas,

K. A. Díaz Jiménez, K.P. Yurov, Doctor en Ciencias Veterinarias.

Palabras clave: diagnóstico, inmunotransferencia, inmunoensayo enzimático, anemia infecciosa equina, reacción de precipitación por difusión Abreviaturas: VIH: virus de la inmunodeficiencia humana, ADN: ácido desoxirribonucleico, SDS: dodecilsulfato de sodio, DTT: ditiotreitol, INAN: anemia infecciosa, ELISA: inmunoensayo enzimático, OIE – Oficina Internacional de Epizootias, RT-PCR – reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa, PAAG – gel de poliacrilamida, RDP – reacción de precipitación por difusión, RN – reacción de neutralización, RNHA – reacción de hemaglutinación indirecta, RTHA – reacción de inhibición de la hemaglutinación, RSK – reacción de fijación del complemento , RTSK – reacción de inhibición de la fijación del complemento

La infección retroviral de los caballos, o INAN, se caracteriza por una persistencia a largo plazo (toda la vida) del patógeno, que junto con los agentes causantes de la leucemia bovina, el VIH, las infecciones lentas en ovinos, etc., pertenece a la familia de los retrovirus (Retroviridae), subfamilia de lentivirus (Lentivirus). La deficiencia del sistema reticuloendotelial, la baja respuesta inmune al virus, la integración estable del genoma viral en el ADN de la célula huésped y la deriva antigénica juegan un papel clave en el mecanismo de persistencia a largo plazo del virus y las recaídas periódicas del virus. enfermedad. Estas características de la patogénesis causan dificultades para diagnosticar y combatir la enfermedad. Clínicamente, la enfermedad puede presentarse en forma aguda, subaguda o crónica.

En el caballo, el virus infecta macrófagos, monocitos y posiblemente otros tipos de células. La respuesta inmunitaria del organismo se produce ante las proteínas virales inmunodominantes responsables de la producción de anticuerpos [5]. Estos últimos se encuentran con

el poder de las reacciones inmunológicas (serológicas) presentadas en la tabla.

Los anticuerpos neutralizantes de las glicoproteínas de superficie del virus aparecen en promedio 30 días después de la infección y se detectan durante muchos años. Sin embargo, el efecto protector de los anticuerpos neutralizantes es bajo. Yu. Kono et al. demostró experimentalmente que el virus INAN está sujeto a la deriva antigénica durante su reproducción en el cuerpo [11]. El suero sanguíneo de un caballo infectado neutraliza el virus que se usa para infectar, pero no es activo contra el virus recién reproducido. Nuevas variantes antigénicas del virus aparecen durante cada recaída de la enfermedad. En este caso, se crea un estado de inmunidad no estéril en el caballo, cuando los anticuerpos específicos y un virus infeccioso están presentes simultáneamente en la sangre. Como resultado, se forman complejos inmunes antígeno-anticuerpo.

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Los cambios patológicos en INAN se deben en gran parte a la respuesta inmunopatológica [7], ya que la respuesta inmune en caballos infectados se asocia con viremia persistente. Los complejos inmunes formados durante INAN a través de reacciones inmunopatológicas inducen glomerulonefritis proliferativa, agotamiento del complemento y fiebre [1, 18]. El estado de inmunidad no estéril (presencia simultánea del virus y anticuerpos contra él en la sangre) permite el uso de métodos inmunológicos para el diagnóstico de INAN. El primer informe sobre el diagnóstico serológico de INAN fue realizado en 1966 por los investigadores japoneses Yu. Kono y K. Kabayashi, quienes propusieron el uso de CSC con un antígeno cultural [12]. Más tarde, sin embargo, resultó que RSC detecta solo anticuerpos tempranos (inmunoglobulinas de clase M). Actualmente, el método principal para determinar los caballos enfermos es el RDP en el gel: la prueba de Coggins [3. 5, 9].

Respuestas inmunológicas en caballos al virus INAN

Anticuerpos Prueba Especificidad Primera aparición Título Duración

Precipitante RDP Grupo 14. 50 días después de la infección, 2. 10 días después de la pirexia 1:4.1:16 (hasta 1:128) De por vida

RSK dependiente del complemento » Igual ~ 1:128 Vida útil (no detectable después de 3.60 días)

RTCK inhibidor dependiente del complemento » » Hasta 1:512 de por vida

pH neutralizante Típico para la cepa 10.60 días después de la infección 1:128.1:256 (hasta 1:2048) Lo mismo

Inhibidor de la hemaglutinación RTGA Lo mismo No establecido Hasta 1:256 »

Hemaglutininas Grupo RNHA 14.50 días después de la infección, 2.10 días después de la pirexia Hasta 1:10240 »

Métodos inmunológicos para el diagnóstico de la anemia infecciosa equina

Moderna estrategia para el diagnóstico serológico INAN

RDP es un método de referencia para el diagnóstico de caballos con INAN, adoptado como estándar internacional. La especificidad de la reacción y la fiabilidad de los resultados fueron probadas por pruebas internacionales de esta prueba, organizadas por el Profesor V. Thomas (Escuela de Veterinaria, Alfort, Francia) [6]. Se ha establecido una correlación estricta entre los resultados positivos de las pruebas y la presencia del virus en la sangre de los animales enfermos [6]. La sangre de caballos positivos para RDP contiene un virus infeccioso y causa una enfermedad típica cuando se administra por vía parenteral a un caballo sano. La confiabilidad de la prueba permitió a la OIE recomendar el PDR para el diagnóstico de INAN en el transporte internacional de caballos, su venta en subastas, participación en competencias ecuestres, etc. [3]. A través del RDP, es posible identificar caballos infectados, independientemente de la forma del curso y la duración del proceso infeccioso.

El principal antígeno viral involucrado en la reacción es un polipéptido de 26 kDa (p26), producto de la expresión del gen gag viral, que constituye alrededor del 40% de la masa total de los polipéptidos del virión. El gen gag es una región altamente conservada del genoma y está presente en todas las variantes antigénicas del virus. En el RDP, los anticuerpos se detectan principalmente contra p26, ya que domina en la composición de los antígenos. En casos raros, los anticuerpos contra el polipéptido p15 pueden detectarse en RDP. En el cuerpo de un caballo enfermo, el virus se replica en monocitos y macrófagos sanguíneos, lo que provoca fiebre y otros síntomas clínicos. La primera vez que la viremia se puede detectar tan pronto como 5 días después de la infección, la respuesta inmune humoral, después de 7 días. En RDP, los anticuerpos antivirales generalmente se detectan 12 días después de la infección. En casos muy raros, los anticuerpos se detectan mucho más tarde. Los caballos infectados siguen siendo portadores crónicos del virus hasta el final de sus vidas, lo que necesariamente se tiene en cuenta en los programas modernos para controlar la propagación de INAN en el mundo [15.25].

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Sin embargo, RDP, como todos los métodos serológicos, tiene desventajas. Por ejemplo, se puede obtener un resultado negativo con muestras de suero recolectadas de caballos enfermos al inicio de la enfermedad, cuando el título de anticuerpos específicos en la sangre no alcanza el nivel necesario para su detección. Dichos caballos deben volver a evaluarse después de 10.14 días. En este caso, el problema no se considera un verdadero resultado falso negativo, a pesar de que los caballos infectados ya son portadores del virus, pero el resultado de RDP permanece temporalmente negativo. En tales casos, se puede utilizar el método RT-PCR modificado con un par de cebadores anidados (“RT-PCR anidada”) para aclarar los resultados [15]. Rara vez se obtienen resultados falsos negativos verdaderos en el estudio de infectados.

RUS INAN de caballos con inmunodeficiencia primaria (congénita) o secundaria [5, 10]. Estos caballos siguen siendo portadores crónicos del virus, pero su infección no puede confirmarse por métodos serológicos. Un resultado positivo, que no es un verdadero falso positivo pero que puede malinterpretarse, ocurre en los potros que adquieren inmunidad pasiva del calostro de la madre afectada pero permanecen libres de infección. En los potros obtenidos de yeguas infectadas, los anticuerpos del calostro permanecen en la sangre, cuyo número disminuye gradualmente durante los primeros tres a seis meses de vida. Es posible establecer la dinámica negativa de los anticuerpos usando ELISA, un método alternativo para examinar caballos para INAN.

El ELISA competitivo para la detección de anticuerpos contra p26 se utilizó por primera vez para diagnosticar INAN en caballos en los Estados Unidos a fines de la década de 80. el siglo pasado La propagación exitosa de ciertas cepas del virus INAN en cultivos de piel de caballo o células renales ha hecho posible producir suficiente virus para preparar un antígeno de diagnóstico para ELISA. Los viriones se purificaron por centrifugación en un gradiente isopicnal, se desintegraron con acetona y los polipéptidos resultantes se separaron en una columna cromatográfica por filtración en gel. Los sistemas de prueba modernos para el diagnóstico de INAN en ELISA, por regla general, incluyen antígenos de proteínas recombinantes obtenidas por ingeniería genética. Actualmente, los kits ELISA comerciales para el diagnóstico serológico de INAN se producen según 4 esquemas: 1) ELISA competitivo, antígeno p26; 2) ELISA indirecto, antígeno p26; 3) ELISA indirecto, antígeno gp45; 4) ELISA indirecto, antígeno p26 + gp45. De acuerdo con los resultados de un análisis comparativo de los sistemas de prueba, el conjunto del esquema No. 3 se considera el más específico, pero en términos de sensibilidad es inferior a todos los demás [17]. En general, ELISA es un método menos subjetivo en comparación con RDP; el cálculo de los resultados de la reacción puede automatizarse por completo. Las ventajas del método son la velocidad de ejecución (alrededor de 2 horas) y la alta sensibilidad. Los resultados de ELISA se correlacionan con los datos de RDP. Se pueden obtener resultados inconsistentes (positivo en ELISA y negativo en RDP) por dos razones: por el bajo nivel de anticuerpos contra p26 en la muestra; debido al contenido en la muestra de anticuerpos contra variedades interespecíficas de p26, que solo pueden determinarse por ELISA, pero no por RDP. Las variedades interespecíficas del antígeno p26 se forman durante la evolución de los lentivirus en la naturaleza [13]. Al mismo tiempo, de acuerdo con las recomendaciones de la OIE, todas las muestras que respondan positivamente a INAN en ELISA deben ser analizadas en el PDR [16].

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La inmunotransferencia es un método mediante el cual se detectan anticuerpos contra varios polipéptidos del virus INAN – p26, gp45 y gp90, homólogos a las glicoproteínas de superficie gp120 y gp41 del VIH. A pesar de que las proteínas gp45 y gp90 se encuentran en

RVZh • SHZH • Nº 1/2013

G K. Yurov, S.V. Alekseenkova, K. A. Díaz Jiménez, K.P. Yúrov

composición del virus INAN en menor cantidad que p26, son antígenos inmunodominantes y estimulan la formación de anticuerpos a un nivel superior que en el caso de p26. Después de la infección, primero se forman anticuerpos contra gp90 y luego contra p26. Esta propiedad se utiliza para diagnósticos tempranos de laboratorio de caballos. Por lo tanto, los caballos infectados pueden detectarse mediante inmunotransferencia antes que en RDP.

Aplicación práctica de métodos alternativos para el diagnóstico de INAN en el laboratorio de virología VIEV

En nuestro laboratorio, para el seguimiento, estudios de diagnóstico y estudios de caballos durante el transporte internacional, además de RDP, se utilizan métodos alternativos, en particular, inmunotransferencia con el antígeno del virus INAN – p26. El orden de aplicación del método se presenta sobre el ejemplo de un caso particular del estudio de los caballos.

La electroforesis SDS-PAGE de polipéptidos del virus INAN y marcadores proteicos de peso molecular de 21 a 97 kDa se realizó en el sistema tampón Lemli [14] en PAAG al 12% en placas de 0,75 mm de espesor en un aparato de electroforesis vertical. La separación de los polipéptidos en condiciones desnaturalizantes con calentamiento en presencia de DTT, la tinción con solución de nitrato de plata al 10% se llevó a cabo según el método propuesto anteriormente [2]. Después de la electroforesis SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa en un sistema tampón semiseco según el método de Burnet [8]. La pista que contenía proteínas marcadoras se tiñó con solución de Coomasi. Las pistas que contenían el antígeno p26 del virus INAN se usaron para la inmunotransferencia. La reacción se realizó con sueros sanguíneos de animales que reaccionaron positiva o dudosamente en RDP. Después de la incubación con sueros, las tiras de membrana se incubaron con un conjugado de inmunoperoxidasa contra Ig equina clase G. Se usó ovoalbúmina a una concentración de 0,2% como solución de bloqueo. Se usó una mezcla de sustrato basada en un cromógeno, ortodianisidina, para manifestar la reacción. Los resultados de un estudio privado en el INAN de diez muestras de suero de sangre de caballo por inmunotransferencia se muestran en la figura. En la muestra No. 6 se encontraron anticuerpos contra el antígeno p26 del virus INAN, con otras muestras se obtuvieron datos negativos. Los resultados del estudio de todas las muestras fueron confirmados en el PDR.

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un resultado positivo, los anticuerpos en el suero sanguíneo de un caballo enfermo interactúan con el antígeno p26 del virus INAN.

La INAN de los caballos se caracteriza por la persistencia a largo plazo (de por vida) del patógeno, independientemente de la forma del curso de la enfermedad: aguda, subaguda o crónica. Al mismo tiempo, los anticuerpos y un virus están presentes simultáneamente en la sangre de los caballos. Los principales cambios patológicos en los caballos se deben a la acción patológica de los complejos inmunes antígeno-anticuerpo.

La respuesta inmunitaria del organismo se desarrolla frente a proteínas virales inmunodominantes responsables de la producción de anticuerpos. Estos últimos se detectan mediante reacciones inmunológicas (serológicas). El método estándar para el diagnóstico de INAN es RDP en gel (prueba de Coggins). Las pruebas inmunológicas (serológicas) permiten identificar caballos enfermos en diferentes etapas del proceso infeccioso y el curso de la enfermedad. Las excepciones son el período inicial de formación de la respuesta inmune humoral, la forma hiperaguda de infección, etc. En tales casos, para la detección directa del virus, se puede recurrir al método RT-PCR modificado con un par de cebadores anidados ( “RT-PCR anidada”).

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Los métodos alternativos incluyen ELISA e inmunotransferencia. Usando inmunotransferencia, es posible detectar anticuerpos contra varios polipéptidos del virus INAN: p26, gp 45 y gp90, glicoproteínas de superficie homólogas gp120 y gp41 del VIH. A pesar de que las proteínas gp45 y gp90 se encuentran en el virus INAN en menor cantidad que p26, son antígenos inmunodominantes y estimulan la formación de anticuerpos a un nivel superior a p26. Esto permite utilizar el método para diferenciar resultados dudosos y falsos positivos.

Ver la bibliografía en http://logospress.ru/

GK Yurov, SV Alexeyenkova, KA Dias-Himenes, KP Yurov. Métodos inmunológicos para el diagnóstico de la anemia infecciosa equina. La anemia infecciosa equina (EIA) se caracteriza por la persistencia de patógenos a largo plazo independientemente del curso clínico: agudo, subagudo y crónico. Los anticuerpos y el virus se presentan en la sangre de los caballos simultáneamente. La causa de los principales cambios patológicos en los caballos es un efecto inmunitario anormal de los complejos antígeno-anticuerpo. La respuesta inmune ocurre en las proteínas virales inmunodominantes responsables de la producción de anticuerpos. El método de diagnóstico estándar de EIA que permite identificar caballos infectados independientemente del curso clínico de la infección es la inmunodifusión en gel de agar (AGID — prueba de Coggins). Los métodos alternativos son ELISA e inmunotransferencia. Para la detección directa del virus en algunos casos se utiliza el método de RT-PCR anidada.

La anemia infecciosa equina es una enfermedad viral aguda y grave. Hasta ahora ha estado entre los problemas más importantes de la virología veterinaria, tanto desde el punto de vista teórico como práctico. La enfermedad se caracteriza por una variedad de formas (aguda, subaguda, crónica, latente, asintomática) y curso, así como la insuficiencia de la respuesta inmunológica del cuerpo a la introducción del virus, por lo que es difícil de diagnosticar [2].

El diagnóstico se realiza de manera compleja, teniendo en cuenta las características epizoóticas, los resultados de estudios clínicos y de laboratorio, cambios hematológicos, patológicos, anatómicos e histológicos.

La anemia infecciosa equina afecta únicamente a los animales de una pezuña: caballos, ponis, burros y mulos. De caballos enfermos a caballos sanos, el virus se transmite a través de las picaduras de insectos chupadores de sangre. Los principales portadores son los tábanos. Los casos de anemia infecciosa se registran con mayor frecuencia en el verano, debido a la gran cantidad de insectos chupadores de sangre. La anemia infecciosa se registra en áreas pantanosas, boscosas, cuencas de ríos. Los casos de enfermedad en caballos en invierno están asociados con una exacerbación de la enfermedad en caballos crónicos o la transmisión del virus durante transfusiones de sangre, vacunas y otras operaciones.

La enfermedad procede en forma de epizootias, a menudo de forma asintomática. Un brote epizoótico de INAN suele durar de 3 a 5 meses. Primero, se detectan caballos enfermos, en los que la enfermedad se desarrolla de forma aguda o superaguda, luego se observan casos de curso crónico y una forma latente (latente) de la enfermedad.

El signo más característico de infección, la anemia, se acompaña de una fuerte disminución de los glóbulos rojos, la hemoglobina, el adelgazamiento de la sangre y el deterioro de su coagulabilidad. El sistema nervioso central se ve afectado, se desarrollan cambios distróficos en el hígado, los riñones, el tracto gastrointestinal, aumenta la degradación de proteínas, se alteran los procesos metabólicos. Se desarrollan las propiedades protectoras del organismo y del sistema reticuloendotelial. La muerte se produce como resultado de una fuerte interrupción del sistema nervioso central, intoxicación, anemia y parálisis cardíaca.

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El diagnóstico de laboratorio de anemia infecciosa se establece sobre la base de estudios serológicos (reacción de percipitación por difusión), hematológicos y patomorfológicos. En casos dudosos se pone una muestra biológica [3,4,5].

Para la investigación, lo siguiente se entrega al laboratorio veterinario: suero de sangre de caballo (5-6 ml) para pruebas serológicas, sangre (10-12 ml) estabilizada con solución de citrato de sodio al 20% para investigación hematológica (la sangre se toma antes de alimentar y beber el caballo), trozos de hígado, bazo, riñones, corazón, pulmones y ganglios linfáticos tomados de animales muertos o sacrificados con fines de diagnóstico para el examen histológico.

Método serológico se basa en la detección de anticuerpos contra el virus de la anemia infecciosa en el suero sanguíneo de caballos sospechosos de la enfermedad mediante el establecimiento de una reacción de precipitación difusa. Como antígeno específico en la reacción, se usa un virus acumulado en un cultivo de leucocitos de caballo o una suspensión del bazo de caballos enfermos.

En el curso agudo de la enfermedad y un período de incubación corto, se pueden obtener resultados negativos en el animal de prueba. En este caso, la sangre se vuelve a examinar después de 10 a 15 días.

Investigación hematológica incluyen la determinación del número de eritrocitos en 1 mm 3 de sangre, la cantidad de hemoglobina y la velocidad de sedimentación globular (VSG).

Para los caballos enfermos, es característico un aumento de la ESR, especialmente en los primeros 15 minutos (60-70 divisiones). La VSG se determina a temperatura ambiente.

Al inicio de la enfermedad, con el primer aumento de la temperatura, generalmente no hay desviaciones bruscas de la norma en la cantidad de glóbulos rojos y el porcentaje de hemoglobina. En animales con enfermedades crónicas, estos indicadores vuelven a la normalidad y la VSG permanece elevada.

Durante la autopsia de los cadáveres de los caballosque fallecieron por INAN, se encuentran múltiples hemorragias en las mucosas, tegumentos serosos, en el tejido subcutáneo y en los órganos parenquimatosos. Las hemorragias pueden ser pequeñas, punteadas o más grandes, de hasta varios cm de diámetro. En una forma grave de la enfermedad con síntomas de toxicosis, se encuentran hemorragias de manchas grandes en la mucosa intestinal, el tracto respiratorio, los músculos y otros tejidos.

Para muestra biológica Se seleccionan dos potros de 6 a 12 meses de granjas libres de enfermedades infecciosas. Los potros se infectan con suero o plasma sanguíneo.

Las observaciones de los animales infectados se llevan a cabo durante 90 días. Una muestra biológica se considera positiva si los potros infectados presentan síntomas clínicos característicos de la enfermedad: fiebre recurrente, debilidad, palidez o coloración amarillenta de las mucosas, emaciación, y si se obtienen resultados positivos de los estudios serológicos y hematológicos. Un bioensayo se considera negativo si los potros experimentales no presentan síntomas de la enfermedad y reciben estudios hematológicos y serológicos negativos [1].

No se ha desarrollado un tratamiento para la anemia infecciosa, los caballos enfermos se destruyen. Por lo tanto, los caballos que han estado enfermos con INAN suelen adquirir cierta resistencia a la reinfección [5].

Lista bibliografica

Directrices temporales para el diagnóstico de laboratorio de caballos (aprobado el 25 de marzo de 1983). – 30 s.

Gosmanov R.G. Virología veterinaria. [Texto] – Libros de texto y estudios. Asignaciones para estudiantes superiores. libro de texto Instituciones / R.G. Gosmanov, N. M. Kolychev – M .: KolosS, 2006. – S. 157-159.

Yurov, K. P. Prevención de enfermedades virales de los caballos. [Texto] – Libro de texto / K.P. Yúrov. – M.: Kolos, 1984. – S. 93-117.

Yurov, K. P. Enfermedades virales de los caballos. [Texto] – Libro de texto / K.P. Yurov, NV Kriukov, NV Lijachev – M. 1972. – 141-143s.

Yurov, K. P. Enfermedades virales de los caballos. [Texto] – Libro de texto / K.P. Yurov, V. E. Sadikov – M .: Kolos. 1973. – S. 105-138.

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